Santa Cruz de la Sierra fue fundada por el capitán español Ñuflo de Chaves el 26 de febrero de 1561, tras una expedición integrada por 158 españoles que partieron de Asunción. La nueva población fue bautizada con el nombre de Santa Cruz de la Sierra en honor a la ciudad natal de Ñuflo de Chaves en Extremadura, España. Esta fundación se realizó a orillas del arroyo Sutó, en la serranía de Chiquitos, como una avanzada al este de los territorios ocupados por España, próximo a donde hoy se asienta San José de Chiquitos. Y hoy, en aquel pueblo recordado como "Santa Cruz la Vieja" se pueden observar los trazados que se hicieron para su población.

La ciudad tuvo dos traslados; cuando Ñuflo de Chaves preparaba una expedición para llegar a territorios de los Moxos, fue muerto en el mes de septiembre de 1568 por un cacique de la parcialidad de los "avá" o guaraníes llamada itatín.

Por avatares históricos, después de muchas penurias, los pobladores de la primigenia ciudad, en 1590 se trasladaron a otra localidad en lo que es ahora el Santuario de Cotoca en manos del Capitán Lorenzo Suárez de Figueroa. En 1591, la mayor parte de la gente llegada de la Chiquitanía siguió su viaje hasta San Lorenzo Real de la Frontera, donde se asentaron definitivamente, manteniendo el nombre de la ciudad natal: Santa Cruz de la Sierra. Una pequeña parte de la gente se quedó en Cotoca durante el traslado.

San Lorenzo Real de la Frontera fue fundada por el capitán español Gonzalo Solíz de Holguín en territorios de los Llanos del Grigotá el 21 de mayo de 1595. Santa Cruz de la Sierra, en el lugar de su primera fundación (en la Chiquitanía), tuvo una existencia de 43 años. Cuando los pobladores fueron trasladados por disposición de la Real Audiencia de Charcas a San Lorenzo Real de la Frontera, antes de llegar se resistieron y se establecieron en lo que ahora es Cotoca. Después de 17 años de vivir en Cotoca, parte de su gente aceptó a los padres jesuitas, y a la propuesta del entonces Gobernador Don Nuño de la Cueva de trasladarse al lugar donde hoy es la ciudad de Santa Cruz de la Sierra. Santa Cruz fue principalmente la región donde se crearon mayores asentamientos jesuitas, misiones o reducciones indígenas. Puesto que en los alrededores aún existía una gran cantidad de pueblos indígenas (muchos de ellos defendidos del avance Español), la labor misionera de los jesuitas llegó a su cúspide con la catequización del total de estos pueblos y la edificación de Conjuntos misionales que hasta hoy perduran, siendo nombrados por la Unesco como Patrimonio Cultural de la Humanidad, tanto que en Bolivia se constituyó el principal asentamiento de las Misiones Jesuíticas del Nuevo Mundo.